Все дипломы > Медицина > Добавить в закладки
Коллеги автора


Оставь голос:
Вы следите за научными мировыми открытиями?
Изредка о чем-то узнаю
Внимательно слежу
Нет - мне не интересно


Процитируем:
...« Приведена терминология, используемая в биосенсорном анализе. Дано краткое определение типам преобразователей, составляющих основу биосенсоров. Представлены характеристики био»...
подробнее

Медицина


Часто просматривают следующие страницы:


Френсис Бекон:

"Невежды презирают науку, необразованные люди восхишаются ею, тогда как мудрецы пользуются ею"



Полевые транзисторы используются для создания биосенсоров для определения активности холинэстераз, а также для создания иммуносенсоров. Для этих двух типов биосенсоров в последнее время предложен ряд оригинальных решений – применение съемных мембран, использование высокоэффективных субстратов фермента-метки в иммуносенсорах. Остановимся более подробно на описании конструкции биосенсоров этого типа.

Определение активности холинэстераз. Одной из актуальных задач в аналитической химии является обнаружение соединений нервно-паралитического действия. К таким соединениям относятся пестициды, отравляющие вещества, применяемые при боевых действиях. В современной обстановке имеются примеры использования отравляющих веществ нервно-паралитического действия террористами против гражданского населения. Механизм биологического действия указанных веществ основан на ингибировании активности ацетилхолинэстеразы – фермента, присутствующего в зонах контакта нервных клеток человека, животных, насекомых. Общее название ферментов этого класса – холинэстеразы (ацетилхолинэстераза (АХЭ), бутирилтиохолинэстераза (БХЭ) и т.д.). Схема анализа ингибитора ХЭ выглядит следующим образом. Биосенсор содержит иммобилизованный фермент, например, АХЭ. Ацетилхолин (субстрат АХЭ), присутствующий в среде измерения, гидролизуется до холина (CH3)3N+CH2CH2OH и уксусной кислоты CH3COO– + H+. В зависимости от типа используемого преобразователя сенсор регистрирует появление либо холина, либо уксусной кислоты. Чем выше концентрация этих соединений, тем выше активность фермента и, следовательно, нет соединений, его ингибирующих, и наоборот. Появление уксусной кислоты может быть зарегистрировано рН-чувствительным полевым транзистором. Интенсивность этой реакции отражает состояние фермента – чем более активна АХЭ, тем выше сигнал. Если же измерение активности фермента происходит в среде, содержащей ингибитор, то сигнал сенсора снижается из-за подавления активности фермента.

В представленном далее примере рассматривается биосенсор на основе бутирилтиохолинэстеразы (БХЭ) и полевого транзистора. Реакцию, протекающую в биорецепторе, содержащем иммобилизованную БХЭ, можно представить в следующем виде:

здесь для бутирилтиохолиниодида (БТХИ), субстрата БХЭ, R = (СН2)2СН3). Изменение рН раствора в результате образования бутановой кислоты  при гидролизе субстрата является основой применения рН-чувствительных электродов для создания биосенсоров. Существовавшие типы электродов характеризовались различными способами иммобилизации ХЭ и, как результат, различными параметрами - чувствительностью к субстратам, ингибиторам, селективностью. Стремление улучшить характеристики сенсоров стимулировало поиск новых эффективных методов иммобилизации биоматериала, более простых, надежных. Следует упомянуть, что одна из проблем детекции ингибиторов ХЭ заключается в том, что многие ингибиторы необратимо блокируют фермент. Если при этом биосенсор устроен таким образом, что фермент иммобилизован на преобразователе химической связью (ковалентно), то для регенерации сенсора требуется довольно сложная и длительная процедура. Такие действия усложняют в целом методику измерения. Поэтому одно из направлений исследований состояло в поиске вариантов анализа, которые позволили бы избежать процедуру регенерации сенсора после детекции соединений, необратимо ингибирующих активность ХЭ.

Один из предложенных подходов основан на использовании сменных биорецепторов. Для ПТ наиболее часто используемым способом иммобилизации ХЭ, позволяющим получить стабильные параметры, является ковалентная пришивка фермента к активированной поверхности сенсора. Описанные способы иммобилизации фермента характеризовались тем, что химическая подготовка поверхности и процедура иммобилизации выполнялась непосредственно на поверхности транзистора. Такой подход обеспечивал высокую стабильность измерений, вместе с тем имел определенные ограничения. Первое - в процессе иммобилизации производилась химическая обработка поверхности транзистора, что потенциально могло приводить к изменению его характеристик. Второе ограничение проявлялось при детекции необратимых ингибиторов. Необратимый ингибитор частично или полностью снижал активность фермента ("выключал" фермент) и его удаление из среды измерения не приводило к восстановлению чувствительности сенсора. Для восстановления активности ХЭ в этом случае использовали процедуру регенерации, которая, как правило, восстанавливает активность фермента лишь частично; при этом после ограниченного числа циклов чувствительность детекции все же снижается, что делает невозможными дальнейшие измерения. Кроме указанного, еще одним узким местом, снижающим эффективное использование ковалентной иммобилизации, является необходимость химической очистки поверхности транзистора для удаления остатков неактивного фермента и подготовки к новому циклу иммобилизации. В связи с изложенным идеальным вариантом при измерениях с помощью ПТ представляется возможность производить формирование рецепторного элемента предварительно вне преобразователя, не сопрягая эту процедуру с химической обработкой поверхности преобразователя. Как известно, такой подход практикуется при амперометрической детекции, однако, длительное время не использовался для биосенсоров на основе ПТ.

Сменный биорецептор. В соответствии с предложенным методом сменный биорецептор представляет тонкую мембрану/матрицу, изготовленную из материала, обеспечивающего свободную диффузию субстратов и продуктов реакции к/от поверхности транзистора и находящуюся в контакте с затворной зоной ПТ. Такая мембрана должна содержать иммобилизованный фермент, а устройство для ее прижима должно обеспечивать плотное прилегание к затворной области и, в случае необходимости, быструю замену мембраны после измерений. Схематически конструкция держателя показана на рис. 4.1.15. ПТ (1) закрепляется на основании (3). Подключение его в измерительную цепь осуществляется через разъем (4). При вертикальном перемещении основания (3) ПТ погружают/удаляют из анализируемого раствора (6). При нажатии кнопки (5) пружинного держателя поверхность транзистора освобождается, что позволяет мембрану с иммобилизованным ферментом (2) помещать на затворную зону ПТ и прижимать держателем. Для замены мембраны после измерения ее освобождают нажатием кнопки (6), удаляют и помещают на ПТ новую. Технически процедура замены выполняется легко, время замены не превышает 2-3 мин.

Рассмотрим типичные параметры биосенсора на основе БХЭ для анализа ингибиторов фермента. Иммобилизацию БХЭ на мембране можно выполнять различными способами. Далее рассмотрены параметры сенсора, для которого иммобилизация выполнялась путем ковалентной пришивки фермента на мембраны Millipore (фирма "Sigma"), изготовленные из ацетилцеллюлозы. Мембраны этого типа имеют пористую структуру с диаметром пор порядка 1.2 мкм. После иммобилизации фермента фрагменты мембран размером 3х3 мм2 отмывают от остаточных реагентов и сохраняют в сухом виде при температуре 40 С.

Рис. 4.1.15. Схематический вид сенсора "транзистор – мембрана – миниатюрный держатель". а) вид сбоку, б) вид прямо (подробности в тексте).

Калибровочные зависимости. Ферментный электрод, изготовленный описанным методом, позволял регистрировать присутствие субстрата в исследуемом растворе, начиная с концентраций порядка 0.3 - 0.5 мМ (общий диапазон детекции). Диапазон линейной зависимости сигнала сенсора от начальной концентрации БХЭ при иммобилизации на мембранах Millipore находился в пределах от 0.5 до 3.0 мг/мл (рис. 4.1.16). Этот параметр важен при измерении концентрации ингибирующего вещества; корректное измерение содержания ингибитора в пробе предпочтительно производить в области линейной зависимости сигнала от содержания фермента в рецепторе.

На правах рекламы
. Купить трубу для наружной канализации, производство труб пвх каталог. |

Главы - параграфы


Так говорят:
Биосенсорный метод анализа химических соединений в...
Автор: Иришка
Ну что я могу сказать? :) От одного только выражен...
Автор: ираида
Только что дочитал последнюю главу. Вообще замечат...
Автор: паша
Данное учебное пособие содержит так много хорошего...
Автор: ромка
Я и в школе химию особенно не понимала, и теперь-т...
Автор: коля


Наука России - Наше будущее!